雷帕霉素对乳腺癌细胞中程序性细胞死亡4表达的影响及其机制的研究

【摘要】研究背景和目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。据广州市疾病控制中心的统计,2012年乳腺癌发病率已居于广州市城市妇女恶性肿瘤的第一位。乳腺癌的治疗目前仍是以手术为主的包括化疗,内分泌治疗、放疗和分子靶向治疗的综合治疗。乳腺癌是一种异质性疾病,根据其激素受体状态及人上皮细胞生长因子受体2(Her2)的表达将其分为不同的亚型,也常常用这些分子标记物来预测其对靶向治疗的反应性。而随着乳腺癌发生及发展机制研究的深入开展,越来越多的基于乳腺癌发生发展的分子机制的靶向药物被发现,如针对HER-2的曲妥珠单抗治疗,大大改善了乳腺癌患者的预后。然而,我们也看到,仍有相当部分的乳腺癌患者出现了复发和转移,由于肿瘤对化疗、内分泌治疗及靶向治疗药物产生了耐药,从而导致治疗失败。因此,对肿瘤耐药及其机制进行研究,有助于克服耐药,提高疗效。大量研究表明,乳腺癌发生及发展过程中涉及许多信号通路,其中PI3K/Akt/mTOR通路在乳腺癌中存在高频率失调,最高可达70%。在乳腺癌中,PI3K/Akt/mTOR通路的激活在促进乳腺癌细胞的生长,抑制癌细胞凋亡,对化疗及内分泌治疗耐药中起着重要作用,并且与肿瘤分期晚,组织学分级高及预后差密切相关。程序性细胞死亡4(programmedcelldeath4,PDCD4)是近年新发现的一种肿瘤抑制基因,目前已经发现PDCD4基因在包括乳腺癌在内的多种肿瘤组织及肿瘤细胞中表达下调或缺失。Jansen等通过western-blot方法对美国癌症研究所提供的来自全身10个不同部位共60株人肿瘤细胞株进行PDCD4水平检测,其中在乳腺癌细胞株中,发现恶性程度较高的人乳腺癌MDA-MB-231细胞中的PDCD4表达下调的程度明显高于MCF-7细胞。Wen等比较了正常乳腺组织、导管原位癌(DCIS)及浸润性导管癌中PDCD4的表达情况,发现与正常乳腺组织相比,DCIS中PDCD4表达水平轻度下调,而浸润性导管癌中PDCD4明显下调,说明PDCD4在调节乳腺癌的进展过程中具有重要作用。PDCD4的表达缺失或者下调可能参与恶性肿瘤进展的过程,并维持其高度侵袭的特性,是独立的肿瘤预后因子。目前关于PDCD4的抑癌机制尚不明确,除了可以诱导细胞凋亡,研究提示PDCD4主要起着翻译抑制因子的作用,通过与真核细胞翻译起始复合物中的eIF4A等直接结合,封闭eIF4A的解旋酶活性；以及eIF4A与eIF4G的结合而抑制与细胞增殖、侵袭有关的转录因子的合成,从而发挥其抗肿瘤效应,另有研究表明PDCD4可以促进TIMP-2(TissueInhibitorofMetalloproteinases-2,一种抑癌基因)的表达,从而抑制人乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力。PDCD4还可以诱导p21Wafl/Cipl水平升高后减少CDK4/6和CDK2引起细胞周期阻滞,从而减少细胞增殖。根据现有文献报导,miR-21、TGF-β、mTOR、COX-2等多种因子都参与了PDCD4的调控过程。其中mTOR/P70S6k信号通路在PDCD4表达的调控中起到重要作用。Dorrello等研究发现,在促细胞分裂素的刺激下,细胞内的S6K1被激活,活化的S6K1(即P70S6k1)使PDCD4在Ser67处迅速磷酸化,随后磷酸化的PDCD4与泛素连接酶SCFβTRCP结合被泛素化,最后被蛋白酶体降解。而Ser突变的PDCD4变异体却不能磷酸化。作为S6K1的同源体,S6K2也被证实可以促进PDCD4的磷酸化降解。由于PDCD4含有两个Akt磷酸化位点Ser67和Ser457,且在体内和体外Akt能够特异地磷酸化PDCD4的Ser67和Ser457残基,因此Akt也被认为直接参与了PDCD4的降解。由于S6k1的活性主要受上游细胞信号通路PI3k/Akt/mTOR的调节,因此任何引起其上游信号活性改变的因子均可通过影响S6kl的活性而间接调控PDCD4的表达。S6K1是mTORC1下游的靶点之一,雷帕霉素治疗可以迅速使S6K1去磷酸化而失活。在mTORC1/S6K1信号通路与ER信号之间存在着密切的关联,ER阳性乳腺癌对内分泌治疗耐药与nTOR信号通路的过度活化引起的不依赖配体的ERa信号的活化相关。S6K1可以直接在Ser167激活ERa,从而导致ERa转录活性增加,促进ER依赖的乳腺癌细胞增殖,而反过来,ERa的活化又导致S6K1表达的增加,形成正向共调节回路。有研究表明P-S6K1在ER阳性乳腺癌中与不良预后相关。S6K1的过表达可提高乳腺癌细胞对雷帕霉素的敏感性。S6K2是S6K1的同源蛋白,也是mTORC1下游的靶点,在乳腺癌中也有过表达。有研究表明S6K2在小细胞肺癌FGF2诱导的化疗耐药中起作用,并且在应答mTOR活化的细胞增殖中起着重要作用。S6K2还可以通过使Akt磷酸化而促进乳腺癌细胞的生长。雷帕霉素也称西罗莫司(sirolimus),是发现的第一个mTOR抑制剂。在细胞内,雷帕霉素首先与FKBP12结合形成复合物,然后再与mTORC1结合,抑制其活性,使细胞周期停滞在G1期,并促进细胞凋亡。临床上已将雷帕霉素及其类似物用于治疗各种实体肿瘤,包括乳腺癌,它可以提高肿瘤细胞对化疗及内分泌治疗的敏感性。但是在实际应用中却发现雷帕霉素的治疗效果有限,且易产生耐药性。其耐药性产生的机制目前尚不十分清楚,可能与RAS/MEK/ERK及TGF-B/CTGF信号通路的激活有关。根据文献报道,MCF-7细胞及MDA-MB-231细胞中均存在mTOR异常激活,两者中Phosho-mTOR水平基本一致,并且两者中均未检测到phosho-Akt,差别在于MCF-7细胞中phosho-S6K1水平明显高于MDA-MB-231细胞,而MDA-MB-231细胞中PDCD4表达的下调较MCF-7明显。另所文献报道,MDA-MB-231细胞对雷帕霉素原发耐药,MCF-7细胞则可对雷帕霉素产生获得性耐药。基于上述研究结果,我们假设PDCD4可能在雷帕霉素治疗乳腺癌耐药中起作用。本研究发现,与正常乳腺组织相比,PDCD4在乳腺癌组织中有不同程度的表达缺失,在不同分子亚型的乳腺癌中缺失率不同,在三阴性乳腺癌和HER2阳性乳腺癌中其表达缺失率明显高于管腔型乳腺癌,且其表达缺失与组织学分级高,淋巴结转移相关,PDCD4表达阳性患者的无病生存及总生存均优于表达阴性者。P70S6K在乳腺癌组织中的表达水平明显高于正常乳腺组织,其表达阳性者无病生存及总生存均明显差于表达阴性者。本研究还发现,雷帕霉素可以上调MDA-MB-231细胞中PDCD4的表达水平,其上调是通过使S6K1及S6K2去磷酸化而实现的,PDCD4表达上调后其细胞增殖受到抑制。雷帕霉素对MCF-7细胞中PDCD4的表达影响与MDA-MB-231细胞完全不同,是先上调而后下调,而这种表达的影响是通过S6K2的磷酸化来实现的,PDCD4的下调导致了细胞增殖的增强。雷帕霉素对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和ER阳性乳腺癌细胞MCF-7中PDCD4表达的影响完全不同,可能是其对雷帕霉素治疗产生耐药的原因之一。因此,本研究为进一步研究雷帕霉素治疗乳腺癌过程中耐药性产生的机制提供了新的实验依据,并为克服这种耐药性提供了可能。本研究分为二部分,摘要如下：第一部分PDCD4及p70S6K在不同乳腺癌组织中的表达及意义目的：研究不同分子亚型乳腺癌组织中PDCD4及p70S6K的表达及其与乳腺癌临床病理特征和预后的关系方法：1.采用免疫组化SP法分别检测不同分子亚型乳腺癌组织中PDCD4及P70S6K的表达,其中Luminal型乳腺癌198例,HER2阳性型64例及三阴性乳腺癌76例。2.比较不同分子亚型乳腺癌组织中PDCD4及P70S6K的表达水平与乳腺癌临床病理特征的关系。3.采用Kaplan-Meier法对各组患者的无病生存及总生存情况进行分析,采用Log-rank检验比较生存曲线间的差异。采用Cox回归模型对各组患者的无病生存及总生存情况进行多因素分析,找出影响预后的因素。结果：1.PDCD4蛋白在不同分子亚型乳腺癌组织中的表达比较：所有乳腺癌组织中PDCD4蛋白总阳性表达率为58.28%,表达缺失率为41.72%。其中管腔型、Her-2阳性及三阴性乳腺癌组织中,PDCD4蛋白的阳性表达率分别为74.36%、33.33%及36.84%,表达缺失率分别为25.64%、66.67%及63.16%。三种分子亚型乳腺癌中PDCD4的阳性表达率之间差异有统计学意义(χ2=51.685,P<0.001)；其中管腔型乳腺癌中PDCD4的阳性表达率高于Her2阳性及三阴性乳腺癌,差异有统计学意义(χ2=35.197,P<0.001,χ2=33.620,P<0.001),而Her2阳性及三阴性乳腺癌中PDCD4的阳性表达率之间差异无统计学意义(χ2=0.186,P=0.666)。癌旁正常乳腺组织中PDCD4蛋白阳性表达率为96.44%。三个亚型乳腺癌组织中PDCD4的阳性表达率均低于癌旁正常组织中,差异有统计学意义(χ2=39.206,P<0.001；χ2=60.398,P<0.001；χ2=65.185,P<0.001)。2.不同分子亚型乳腺癌组织中p70S6k的表达：正常乳腺组织中不表达p70S6k。所有乳腺癌组织中,p70S6k的阳性表达率为23.96%,其中管腔型、Her-2阳性及三阴性乳腺癌组织中,p70S6k蛋白的阳性表达率分别为12.06%、38.09%及36.84%,各型乳腺癌组织中p70S6k的阳性表达率之间差异有统计学意义(χ2=30.204,P<0.001)。Her2阳性及三阴性乳腺癌中p70S6k的阳性表达率高于管腔型乳腺癌,差异有统计学意义(χ2=21.675,P<0.001,χ2=22.027,P<0.001),Her2阳性及三阴性乳腺癌中p70S6k的阳性表达率之间差异无统计学意义(χ2=0.023,P=0.879),。3.PDCD4表达对不同分子分型乳腺癌预后的影响：单因素分析结果显示,338例乳腺癌中PDCD4表达阳性者其无病生存及总生存均明显优于表达阴性者(χ2=71.403,P<0.001；χ2=34.919,P<0.001)；而在各分子亚型乳腺癌中,同样显示出PDCD4表达阳性者其无病生存及总生存明显优于表达阴性者。多因素分析显示,影响乳腺癌无病生存的独立因素包括肿瘤T分期,N分期及PDCD4表达(P<0.01,P<0.01,P<0.001)；影响乳腺癌总生存的独立因素包括组织学分级,肿瘤T分期,N分期及PDCD4表达(P<0.01,P<0.01,P<0.001,P<0.01)结论：1.乳腺癌组织中PDCD4蛋白表达呈现不同程度的缺失,其中Her2阳性及三阴性乳腺癌中PDCD4蛋白表达缺失最明显。2.乳腺癌组织中P30S6K蛋白表达较正常乳腺组织明显增多,其中Her2阳性及三阴性乳腺癌中P70S6K蛋白表达增多最明显。3.乳腺癌组织中PDCD4蛋白表达缺失与组织学分级高,淋巴结转移相关。4.无论何种分子亚型,PDCD4表达阳性的乳腺癌其无病生存及总生存均优于表达阴性者。第二部分雷帕霉素刺激对三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231及ER阳性乳腺癌细胞株MCF-7中PDCD4表达的影响及机制目的：研究雷帕霉素刺激后三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231及ER阳性乳腺癌细胞株MCF-7中PDCD4表达的变化及意义方法：1.MDA-MB-231细胞及MCF-7株培养传代后,100nM雷帕霉素处理细胞株2.分别在处理后24小时及48小时,westernblot分析雷帕霉素对两个细胞株中PDCD4表达水平的影响3.分别在处理后24小时及48小时,westernblot检测两个细胞株中P70S6K1及P70S6K2的表达变化,研究雷帕霉素影响两个细胞中PDCD4表达的机制4.雷帕霉素刺激两种细胞株后,检测细胞增殖情况,研究雷帕霉素影响PDCD4表达的意义5.所有数据采用SPSS17.0软件包进行统计学处理,western-blot结果记录为均数±标准差,采用单样本t检验或独立样本t检验进行统计学分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.雷帕霉素100nM分别孵育MDA-MB-231细胞24h、48h、Westernblot检测PDCD4在MDA-MB-231细胞中的表达,结果显示雷帕霉素孵育细胞24h、48h后均上调了MDA-MB-231中PDCD4的表达。(P<0.05,n=3,VS0h组)；雷帕霉素100nM分别刺激MCF-7细胞24h、48h、Westernblot检测PDCD4在MCF-7细胞中的表达,结果显示雷帕霉素孵育细胞24h后也上调了PDCD4的表达。但雷帕霉素孵育细胞48h后,MCF-7中PDCD4的表达却显著下调了(P<0.01,n=3,VS0h组)2.雷帕霉素100nM孵育MDA-MB-231细胞24h,Westernblot检测PDCD4、p-S6K1及p-S6K2在MDA-MB-231细胞中的表达,结果显示雷帕霉素孵育细胞24h后,在PDCD4表达上调的同时,p-S6K1及p-S6K2的表达均下调。(P<0.01,n=3,VScontrol);雷帕霉素100nM孵育MCF-7细胞24h,Westernblot检测PDCD4、p-S6K1及p-S6K2在细胞中的表达,结果显示雷帕霉素孵育细胞24h后,p-S6K1的表达下调了(P<0.05,n=3,VScontrol),p-S6K2的表达与空白对照及DMSO组比较差异无统计学意义(P=0.839,n=3,VScontrol)3.雷帕霉素100nM孵育MDA-MB-231细胞48h,Westernblot检测PDCD4、p-S6K1及p-S6K2在MDA-MB-231细胞中的表达,结果显示在PDCD4表达上调的同时,同样p-S6K1及p-S6K2的表达均下调了,以p-S6K1更为显著。(P<0.01,n=3,VScontrol);雷帕霉素100nM孵育MCF-7细胞48h,Westernblot检测PDCD4.p-S6K1及p-S6K2在MCF-7细胞中的表达,结果显示在PDCD4表达显著下调的同时,p-S6K2的表达上调(P<0.01,n=3,VScontrol),p-S6K1的表达与对照组比较差异无统计学意义(P=0.769,n=3,VScontrol)。4.雷帕霉素刺激MDA-MB-231细胞株后,随着刺激时间延长,细胞增殖被明显抑制；雷帕霉素刺激MCF-7细胞株后,随着刺激时间延长,细胞增殖在24h被抑制,其后细胞增殖呈现增强趋势。结论：1.雷帕霉素刺激可上调MDA-MB-231细胞株中PDCD4的表达,其上调PDCD4表达可能是通过下调P-S6K1及P-S6K2的表达实现的；2.雷帕霉素刺激先上调后下调MCF-7细胞株中PDCD4的表达,雷帕霉素对MCF-7细胞株中PDCD4表达的影响与MDA-MB-231细胞株不同,在刺激早期是由P-S6K1下调实现的,后期则是通过过上调P-S6K2的表达实现的3.雷帕霉素上调MDA-MB-231细胞株中PDCD4表达后,可抑制其细胞增殖,表明PDCD4表达上调可能解除了MDA-MB-231细胞株对雷帕霉素的耐药性；雷帕霉素先上调后下调MCF-7细胞株中PDCD4表达后,其细胞增殖先受抑制其后抑制解除,表明PDCD4表达下调可能导致了MCF-7细胞株对雷帕霉素产生获得性耐药4.乳腺癌细胞中PDCD4表达的下调在乳腺癌对雷帕霉素耐药中起作用。
【作者】韩晓蓉；
【导师】黄宗海；
【作者基本信息】南方医科大学，普通外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】乳腺癌；程序性细胞死亡因子4；雷帕霉素；MCF-7细胞株；MDA-MB-231细胞株；核糖体蛋白S6激酶1；核糖体蛋白S6激酶2；

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